细胞裂解液的制备

一、试剂准备

1. 新鲜配制冷的RIPA裂解缓冲液：
  150mM NaCl
  1% NP-40（去垢剂）
  0.1% SDS（去垢剂）
  2 μg/ml Aprotinin（蛋白酶抑制剂，使用前加入）
  2 μg/ml Leupeptin（蛋白酶抑制剂，使用前加入）
  1 mM PMSF（蛋白酶抑制剂）
  15 mM EDTA（蛋白酶抑制剂）
  1 mM Na Vanadate（磷酸脂酶抑制剂，任选）
以上所有试剂均按比例溶于150 mM NaCl溶液中。

2. 冷的PBS中加入1 mM PMSF、15 mM EDTA、1 mM Na Vanadate（钒酸钠，任选）。

3. 选择对数期生长状态良好的细胞，75 cm²至少3-4瓶（90%以上生长面积）。

二、实验步骤

1. 将含有细胞的培养瓶放置于冰上，使用吸液管吸出培养液。加入足够的冷PBS，以充分洗涤细胞表面，去除瓶内残留的培养基，倒掉PBS，重复该过程2-3遍。在最后一次洗涤时，尽量吸干残留PBS，保持在冰上操作。

2. 向培养瓶中加入冷的RIPA裂解缓冲液（每75 cm²培养瓶加1 ml），使用细胞刮子沿瓶壁开始刮细胞。如果有多瓶同种细胞需处理，将第一瓶的细胞液吸出转入下一瓶中继续刮取（由于处理后的细胞裂解液较粘稠，因此建议使用直径较大的吸液管）。

3. 将收集好的细胞裂解液置于14 ml离心管中（置于冰上），然后重复步骤2，以刮取剩下的细胞。

4. 尽可能收集更多的细胞裂解液到14 ml离心管中，样品放入冰盒进行超声处理，超声强度以不产生泡沫为标准，每次超声2-3秒，重复3-4次。如仍有细胞碎片或沉淀，应以10,000 rpm离心10分钟，保留上清液。

5. 取出少量细胞裂解液测定蛋白浓度（可使用Biorad Bradford试剂盒或紫外分光光度计在A280波长测定），并分装保存于-70℃。

细胞裂解方法

细胞裂解一般采用物理或化学方法：

物理法：
(1) 反复冻融：将细胞多次放置于-20℃冷冻和25-30℃环境下，反复冷冻溶解10-20次，适用于如血细胞等大多数哺乳动物细胞。
(2) 煮沸法：将细胞置于100℃沸水中煮沸5-10分钟，适用于多数微生物细胞。
(3) 超声法：使用超声破碎仪以特定频率处理细胞，适用绝大多数微生物细胞。
(4) 渗透压法：将细胞放于纯水等低渗溶液中，使细胞吸收大量水分导致破裂。
(5) 液氮法：通常用于植物细胞的破碎。

化学法：
(1) 强酸、强碱溶液：如0.5N NaOH溶液，可裂解绝大多数动物和微生物细胞。
(2) 生物酶：使用溶菌酶、蛋白酶K等酶用于微生物细胞的裂解。

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